评述与展望

农杆菌介导的高粱遗传转化研究进展  

邵玉涛 , 王振杰 , 贾晋 , 潘建刚
内蒙古科技大学数理与生物工程学院, 包头, 014010
作者    通讯作者
《分子植物育种》网络版, 2016 年, 第 14 卷, 第 1 篇   doi: 10.5376/mpb.cn.2016.14.0001
收稿日期: 2016年01月08日    接受日期: 2016年02月06日    发表日期: 2016年02月10日
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引用格式(中文):
邵玉涛等, 2016, 农杆菌介导的高粱遗传转化研究进展, 分子植物育种(online), 14(1): 1001-1007(doi:10.5376/mpb.cn. 2016.14.0001)
引用格式(英文):
Shao et al., 2016, Progress on Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation in Sorghum, Fenzi Zhiwu Yuzhong (online) (Molecular Plant Breeding), 14(1): 1001-1007 (doi: 10.5376/mpb.cn.2016.14.0001)
 

摘要

高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)对高温和干旱具有很强的耐受能力,是干旱、半干旱地区人们理想的谷类作物。通过现代遗传转化的手段提高高粱的产量,改善其品质显得尤为重要。农杆菌介导的遗传转化是将外源基因转入植物细胞最常用的方法。然而,从2000年首次报道农杆菌介导的高粱遗传转化以来,至今成功的例子仍然非常有限。优化影响农杆菌介导的高粱遗传转化的关键参数(筛选适合转化的基因型与外植体, 选择合适的农杆菌株, 建立有效的组织培养和再生体系, 利用高效的选择, 筛选系统),必将会提高转化效率,拓宽转化范围,为进一步开展高粱的遗传转化研究提供科学依据。

关键词
农杆菌介导; 遗传转化;高粱

高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)是世界上重要的禾谷类作物之一,分布于全球六大洲、71个国家,种植面积达44.4百万公顷,谷物生产占据了全球禾谷类总量的3.5%,每年大约提供57.9百万公吨的谷物产量(FAO,2004,http://www.fao.org/docrep/008/y5473m/y5 473m00.HTM)。高粱对高温和干旱具有很强的耐受能力,是干旱、半干旱地区人们理想的谷类作物。随着全球性的气候变化,极端温度的出现和水的有效性变化必将使高粱这样的旱地作物得到更高的关注。而随着这些可能的变化,提高高粱类作物的产量,改善其品质将显得尤为重要(Gurel et al., 2009)。然而,由于供体种质中缺乏可利用的有用基因,以及有性杂交不亲和性使得远缘杂交变得尤为困难,使得采用传统育种方法对高粱遗传改良受到了限制。而遗传转化和离体技术可以将农艺上有用的基因导入高粱基因组,产生新的基因型,满足了遗传改良的需求(Girijashankar and Swathisree, 2009)。

已经报道的用于高粱遗传转化的方法有四种,即电穿孔法、基因枪法、花粉管通道法以及农杆菌介导法(Girijashankar and Swathisree, 2009)。然而,农杆菌介导的遗传转化是将外源基因转入植物细胞的最常用的方法(Verma et al., 2008)。根癌农杆菌Ti质粒基因转化系统是一种借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞转移的方法。与其他几种遗传转化方法相比,农杆菌介导的遗传转化在减少转基因的拷贝数,降低转基因沉默,提高基因在转基因植物中的稳定表达方面具有显著的优势(刘宣雨等, 2011)。

Zhao等(2000)首次报道了农杆菌介导的高粱遗传转化,该项研究利用幼胚作为受体材料,从6 000多个幼胚中共获得131个稳定转化个体,转化效率平均达到了2.1%。除了少数重要农艺性状基因,如赖氨酸tRNA合成酶基因(可提高籽粒中赖氨酸含量) (Lu et al., 2009),几丁质酶基因Chi (可提高抗病性) (Indra Arulselvi et al., 2010),杀虫晶体蛋白基因cry1Ab、Cry1C (可提高对玉米螟和大螟的抗虫性) (张明洲等, 2009; 朱莉等, 2011; Ignacimuthu and Premkumar, 2014)被用于农杆菌介导的高粱转化,其他大部分农杆菌介导的高粱转化的研究主要集中在提高转化和再生频率上(Jeoung et al., 2002;Carvalho et al., 2004; Gao et al., 2005 a, b; Howe et al., 2006; Nguyen et al., 2007;Gurel et al., 2009),转化效率一般在2%~8%之间。

与玉米、水稻等单子叶植物相比,农杆菌介导的高粱遗传转化的进展还相对缓慢(Hiei et al., 2014)。影响农杆菌介导法转化高粱的因素有很多,这些因素影响了目标基因能否成功导入植物体,以及能否成功进行稳定的整合和表达。优化影响高粱遗传转化的关键参数,无疑会提高转化效率,拓宽转化范围(Shrawat and Lörz, 2006)。
 

1筛选适合转化的基因型与外植体
1.1基因型
植物的基因型是影响单子叶植物进行农杆菌介导的遗传转化的一个很重要的因素。一般情况下,在小麦、玉米、大麦和甘蔗中,运用基因枪法获得转化成功的模式基因型在农杆菌介导的遗传转化中较为有效。在一些禾谷类作物中也有人运用优良品种(如高粱的PHI391)用于遗传转化,但总的转化效率要比模式品种低很多(Cheng et al., 2004)。


已经报道可用于农杆菌介导的高粱转化的基因型包括:296 B、C2-97、C401、CO25、M35-1、P898012、Pion-eer 8505、PHI391、Sensako 85/1191、Tx430、TNS586、APK 1、BABUSH、MN-3025、115、ICS21B、5-27 (表1),其中P898012和Tx430应用的最为广泛(Hiei et al., 2014)。
 


表1 农杆菌介导的高粱遗传转化
Table 1 Details of Agrobacterium-mediated genetic transformation in sorghum

1.2外植体 
一个良好的农杆菌遗传转化系统不但需要较高的转化效率,而且还需要保证转化植株能够有效的再生。因此,选择受体材料十分重要,受体材料不仅要对农杆菌高度敏感,以期获得更高的转化效率,而且要保证受体材料能够高效再生。尽管已经有多种外植体被用于高粱转化研究(表1),但幼胚被优先作为外植体用于农杆菌介导的高粱转化(Gir-ijashankar and Swathisree, 2009)。研究表明,适合转化的幼胚的理想大小和年龄分别为1.0~1.5 mm,授粉后9~14 d (Zhao et al., 2000; Nguyen et al., 2007; Gurel et al., 2009; Lu et al., 2009)。此外,外植体的来源对转化效率也有很重要的影响。Lu等(2009)发现温室收获的幼胚获得了更高的转化效率,然而,Zhao等(2000)却发现野外收获的高粱幼胚比温室收获的幼胚获得了更高的转化效率。Carvalho等(2004)发现供体植物的生长状态,外植体的类型是影响农杆菌介导的高粱遗传转化的关键因素,利用活力强的幼胚作为外植体进行农杆菌浸染,能够显著提高转化效率。
 
2选择合适的农杆菌株
常用的农杆菌菌株可分农杆碱型(琥珀碱型)、胭脂碱型和章鱼碱型3大类,代表菌株分别为EHA101/EHA105、C58和LBA4404 (刘宣雨等, 2011)。不同的农杆菌株所侵染的宿主范围不同,因而当它们侵染同一植物时所获得的转化效率也会相差很大。已经报道的成功用于农杆菌介导的单子叶植物遗传转化的菌株主要有三个,即LBA4404,C58和EHA101,以及它们的衍生物(EHA105从EHA101, AGL0和AGL1从EHA101) (Cheng et al., 2004)。成功用于农杆菌介导的高粱转化研究中的农杆菌菌株有LBA4404、EHA101、EHA102、EHA105、AGL1、NTL4 (表1)。最近研究表明,与LBA4404相比,AGL1能够获得更高的转化效率(Wu et al., 2014)。

3建立有效的组织培养和再生体系
3.1抗坏死
高粱在组织培养的过程中会频繁地向培养基中释放酚类物质,使得部分植物组织坏死、褐化,不仅会影响植株的再生,也会对用于转化的农杆菌株产生毒害(Gurel et al., 2009;Lu et al., 2009),因此,组织培养的经验对于建立农杆菌介导的遗传转化体系是非常必要的(Saikishore et al., 2011)。Nguyen等(2007)发现在愈伤组织诱导培养基中添加活性炭能够减少酚类化合物的产生。其他研究发现,在共培养基中添加脯氨酸,天冬氨酸,半胱氨酸和椰子水,能够有效缓解褐化,减少组织坏死,提高幼胚的成活率(Zhao et al., 2000; Carvalho et al., 2004;Pandey et al., 2010)。此外,在培养过程中添加PVP或PVPP有助于缓解褐化,增加高粱的遗传转化效率,进一步研究发现PVPP阻止褐化的效果要优于PVP (Gurel et al., 2009;Lu et al., 2009)。Wu等(2014)通过在培养基中添加硫酸铜和6-苄氨基嘌呤使得转化效率达到了33.2%。
 
3.2受体材料预处理
研究表明,在对受体材料进行农杆菌侵染前进行适当的预处理能够显著提高转化效率。Nguyen等(2007)发现,在农杆菌浸染前冷处理未成熟种子(从中分离胚外植体)对外植体存活和愈伤形成均有积极的影响。其中,在4℃预处理未成熟种子一天,显著提高了愈伤组织的形成,减少了频繁继代培养的必要。Gurel等(2009) 将幼胚做43℃热处理3 min后转为25℃冷却,进行农杆菌侵染,获得了8.3%的转化效率;但4℃冷处理则不利于转化。Gurel等(2012)采用上述热处理方法对受体材料P898012的幼胚进行预处理后,再进行农杆菌侵染能够显著提高转化效率,最高可达7%。
 
3.3 Vir区基因的活化
植物受到损伤后会产生酚类物质,透过农杆菌的细胞膜活化并诱导包括VirA、VirG及其他Vir区基因的表达。Vir基因的活化作用于T-DNA的加工和转移,T-DNA进入植物细胞并整合到核DNA上(刘宣雨等, 2011)。然而,高粱组织培养过程中产生的酚类物质会造成植物的组织坏死和细胞的程序性死亡,从而抑制农杆菌介导的转化。因此,在解除酚类物质抑制作用的同时,可以通过添加诱导物来促进Vir区基因的活化和表达。高粱中常使用农杆菌Vir基因诱导物——乙酰丁香酮(AS)对Vir基因进行活化(Cheng et al., 2004)。Zhao等(2000),Gao等(2005a)在农杆菌介导的高粱遗传转化研究中,采用100 µmol/L的AS作为诱导物,获得了较高的转化效率;Jeoung等(2002)对9种不同农杆菌/高粱基因型组合添加了4种不同浓度(50~1 000 µmol/L)的AS,通过比较其绿色荧光蛋白基因(gfp)的瞬时表达情况发现,不同的农杆菌/高粱基因型组合获得最高gfp表达效率所需的AS浓度也不一样。Shridhar等(2010)在农杆菌介导的高粱遗传转化研究中,利用200 µmol/L的AS作为诱导物,最终获得了4.28%的转化效率。Indra Arulselvi等(2010)通过比较3种不同浓度AS对农杆菌介导的高粱遗传转化的影响,发现浓度在200 µM时转化效率最高。
 
4利用高效的选择、筛选系统
4.1选择标记基因
使用选择标记基因可以使转化体在选择压力下被选择出来。已经报道的农杆菌介导的高粱转化中广泛使用的标记基因为除草剂抗性基因(bar) (Zhao et al., 2000;Lu et al., 2009; Indra Arulselvi et al., 2010; Zhu et al., 2011; Wu et al., 2014)。Bar基因编码草丁膦乙酰转移酶(PAT),可以使转化植株对除草剂草丁膦(PPT)及其类似物,如Basta、Liber-ty和bialaphos等产生抗性。利用bar基因能够精确筛选除草剂抗性基因,但利用bar基因进行选择容易出现逃逸现象,人们担心转基因植株中的bar基因能够通过与高粱的野生近缘种进行天然杂交而逃逸到环境中,产生抗除草剂的“超级杂草”(Gao et al., 2005b)。
 
某些抗生素抗性基因也被用于高粱筛选,如潮霉素磷酸转移酶基因(hpt) (Carvalho et al., 2004; Nguyen et al., 2007; Indra Arulselvi et al., 2010; Shridhar et al., 2010;Ignacimuthu et al., 2014; Zhang et al., 2014),新霉素磷酸转移酶基因(npt II) (Howe et al., 2006; Zhang et al., 2014)。然而,使用抗生素抗性基因也可能带来安全隐患——如果这些基因转移到致病细菌中,会产生让抗生素失效的“超级细菌”,威胁人类的健康。
 
利用非除草剂抗性和非抗生素抗性的选择标记,将无疑会减少对环境和生物安全的潜在危害。manA基因可能是一种比较理想的非毒性选择标记基因,该基因编码磷酸甘露糖异构酶(PMI),能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸。转化细胞能够以甘露糖作为碳源而正常生长,而非转化细胞则由于没有可利用的碳源停止了生长(Gao et al., 2005b)。目前,已有多项研究利用manA基因对高粱转化株进行选择,并取得了良好的效果(Gurel et al., 2009; Gao et al., 2005 b; Gurel et al., 2012; Wu et al., 2014)。
 
4.2报告基因
报告基因是一类可以非常方便地通过瞬时表达来检测其表达产物的基因,将其与目的基因相融合,可以通过报告基因的表达情况来确定转化的目的基因是否得到表达。农杆菌介导的高粱转化中,应用最为广泛的报告基因为编码β-葡萄糖苷酸酶(GUS) 的gus基因 (Zhao et al., 2000; Jeoung et al., 2002; Carvalho et al., 2004; Howe et al., 2006; Nguyen et al., 2007; Verma et al., 2008; Lu et al., 2009;Indra Arulselvi et al., 2010;Ignacimuthu et al., 2014; Zhang et al., 2014)。然而,利用GUS作为一个报告系统的最大缺点是它需要一个破坏性的实验,妨碍了所鉴定的转化组织的进一步增殖和再生(Girijashankar and Swathisree, 2009)。
 
另外一个重要的报告基因gfp (编码绿色荧光蛋白GFP)也被成功应用于农杆菌介导的高粱遗传转化研究(Jeoung et al., 2002;Gao et al., 2005a, b; Gurel et al., 2009; Shridhar et al., 2010; Gurel et al., 2012)。该报告系统是一个不具破坏性的可视系统,有利于所鉴定转化组织的恢复。可见,在转基因植株的早期检测过程中GFP系统要优于GUS系统(Girijashankar and Swathisree, 2009)。此外,另外两种可视报告系统,即DsRed (编码红色荧光蛋白) 和YFP (编码黄色荧光蛋白) 也被用于农杆菌介导的高粱转化研究中(Wu et al., 2014)。
 
5问题及展望
农杆菌介导法能够产生较高的转化效率,并且能将单拷贝基因插入基因组并进行整合,是至今用于高粱遗传转化的最有效的方法。然而,从2000年首次报道农杆菌介导的高粱遗传转化以来,至今成功的例子仍然非常有限。目前,利用农杆菌介导法进行高粱遗传转化所面临的主要问题包括:(1)高粱组织培养过程中产生的酚类物质会造成植物组织的坏死,严重影响转化植株的再生;(2)对基因型与外植体要求较高,缺乏成熟的转化方法,难以建立高效转化的体系;(3)大部分研究主要集中在提高转化和再生频率上,只有少数农艺性状基因在以农杆菌介导的高粱遗传转化中得以应用。
 
随着利用农杆菌介导法进行高粱遗传转化的转化策略和转化机制的不断研究与发展,今后的研究可集中在以下几个方面:(1)不断优化高粱的组织培养和再生体系,提高转化植株的再生频率;(2)改善转化方法,对基因型与外植体,农杆菌株,以及选择、筛选系统等影响转化的关键参数进行进一步的优化;(3)将更多农艺性状相关基因应用于农杆菌介导的高粱遗传转化,获得具有高品质、抗病虫害等有益性状的转基因植株。相信通过以上努力,必将能提高农杆菌介导的高粱遗传转化的效率,拓宽转化范围,并极大地促进高粱转基因研究工作的发展。
 
作者贡献
邵玉涛是本综述的主要撰稿人,负责完成资料的收集整理以及论文初稿的撰写;王振杰,贾晋和潘建刚参与部分资料的收集和论文内容的修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
 
致谢
本研究由内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY152)和内蒙古科技大学创新基金项目(2014QDL008)共同资助。
 
参考文献
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